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Nature子刊再發楊柏華教授新作:circYAP調控YAP蛋白翻譯
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2019-05-16 | 297 次瀏覽 | 分享到:

    515日,Nature子刊Cell Death & Differentiation在線發表了加拿大多倫多大學楊柏華教授團隊的一項研究成果,報道發現YAP基因來源的circRNA可拮抗YAPmRNA翻譯起始過程,調控其母基因的翻譯效率[1]。楊柏華教授是今年第五屆circRNA論壇邀請的主講嘉賓之一,本文報道的研究工作曾在去年的第四屆circRNA研究論壇中與大家分享過。期待各位同仁能參加第五屆circRNA研究論壇,屆時一起聆聽楊教授與大家分享他的最新研究成果。

 

YAPHippo通路的關鍵分子之一,與腫瘤發展進程密切相關。本文作者發現來自YAP1基因的4-5外顯子的circRNA,circYAPcircBank IDhsa_circYAP1_008)可以通過結合翻譯起始蛋白eIF4GPABP,抑制母基因YAPmRNA翻譯起始,調控YAP蛋白的表達量,首次發現circRNA通過調控翻譯起始效率調控母基因功能。下面就讓我們一起學習一下這篇文章如何一步步發現這一新穎的機制的:

 

 

1 circYAP調控YAP mRNA翻譯起始的機制 ([1]

 

 

circYAP抑制YAP蛋白表達

    在乳腺癌標本中,circYAP呈現低表達的狀態,做一些腫瘤和非腫瘤的細胞系中也表明circYAP在非腫瘤的細胞系中表達顯著高于腫瘤細胞系,但YAP蛋白在腫瘤細胞系中顯著增高。這一現象表明circYAP的表達水平與YAP蛋白存在負相關性,為進一步證實這一現象,作者通過構建過表達circYAP進行驗證。

 

2 circYAP在腫瘤中低表達,與YAP蛋白表達呈現負相關 ([1]

 

有趣的是,在過表達circYAP之后,YAP蛋白的表達水平顯著降低。

 

3 過表達circYAP顯著降低YAP蛋白表達水平 ([1]

 

circYAP影響YAP mRNA的翻譯狀態

蔗糖密度梯度離心可以有效分離亞細胞組份,該技術可實現對結合單個核糖體的(monosome)和多個核糖體(polysome)的mRNA實現有效分離,常用于mRNA翻譯研究。為進一步分析circYAP如何調控YAP蛋白表達水平的機制,作者用蔗糖密度梯度離心分離monosomepolysome,收取不同蔗糖密度層組分后PCR分析YAP mRNA的分布狀態。結果發現過表達circYAP后,YAPmRNA呈現顯著的位移,表現為低密度對應的組分中YAP mRNA明顯增多,而另外兩種mRNAMDM2GAPDH)沒有這種現象。這說明circYAP過表達后,結合在YAP mRNA上的核糖體數目顯著降低,更多傾向于monosome狀態。這一實驗結果暗示circYAP很有可能是影響了YAP mRNA翻譯起始狀態,阻礙了核糖體有效組裝和往下游的滑動翻譯。

 

4  circYAP影響YAP mRNA的翻譯狀態 ([1]

 

過表達circYAP不影響YAP蛋白的亞細胞定位和YAP mRNA的表達量。干擾circYAP也不影響YAP mRNA的表達量,但卻能顯著增加YAP蛋白的表達量。這些結果進一步表明circYAP并非通過影響YAP mRNA的表達狀態影響YAP蛋白的表達豐度。m7GTP pull-down可以用于分析效率,作者分析了過表達circYAP,對應序列的linear YAP及全長YAP mRNA等過表達條件,結果顯示幾組均有正常的翻譯過程,表現為eIF4G,eIF4E可以被有效捕獲。

 

5  circYAP不影響YAP亞細胞定位 ([1]

 

circYAP通過結合eIF4GPABP抑制YAP mRNA的翻譯起始

從上述結果不難看到,過表達circYAP并不能顯著改變eIF4GeIF4E結合在m7G的狀態,說明circYAP不會廣泛影響mRNA的翻譯狀態,或許是YAP基因特有的一種調控機制。為進一步探究這一現象,作者首先分析了circYAP與翻譯起始過程有關的蛋白的相互作用情況,結果發現circYAP可以結合eIF4GPABP。RNA pull-down實驗證明circYAP可結合eIF4GPABP,但與circYAP序列一致的線性RNA卻不能。有趣的是,過表達circYAP并不影響eIF4GPABPYAP mRNA的結合。

 

6  RNA pull-down驗證circYAP特異性結合eIF4GPABP [1]

 

過表達circYAP不影響eIF4GPABP的表達水平。干擾circYAP可減少eIF4GPABP結合的circYAP量,過表達則增加?;?/span>RNase消化實驗進一步證實了circYAPeIF4GPABP的相互作用。作者選擇了RNase ARNase R進行實驗,RNase A可以降解所有的RNA,而RNase R僅消化線性RNA。用eIF4GPABP抗體IP后產物分別用RNase ARNase R消化,看PABPeIF4G被捕獲的效率(正反向的IP驗證實驗),結果表明,當存在circYAP的時候PABPeIF4G均能被有效的相互捕獲,但當RNase A消化后,它們相互被捕獲的效率顯著下降。

 

7  circYAP促進eIF4GPABP相互作用 ([1]

 

除了eIF4GPABP蛋白,作者也基于RNA pull-down驗證了circYAPYAP mRNA的相互作用情況。結果表明circYAPYAP mRNA可以被相互捕獲。

 

8 circYAPYAP mRNA可以被相互捕獲 ([1]

 

circYAPeIF4GPABPYAP mRNA結合位點分析

上述結果充分證明了circYAP,YAP mRNAeIF4GPABP的相互作用關系,接下來需要弄清楚circYAP分別通過什么序列與eIF4GPABP相互作用的。作者的做法是基于生物信息學預測分析后設計封閉探針,然后驗證相關相互作用被影響的情況。作者用RIsearchRNAplex工具預測了circYAPeIF4GPABP相互作用位點的序列,分析到了兩個打分比較高的序列區段,然后針對這兩個區段分別設計了封閉探針。

RNA pull-down實驗表明兩個探針均可以有效的阻止circYAP捕獲YAP mRNA的效率,但不影響內源circYAPYAP mRNA的表達量。兩個封閉探針也能有效阻斷circYAP捕獲eIF4GPABP蛋白的效率,不影響它們的表達量,也不影響YAP mRNA捕獲兩種蛋白的效率。兩種封閉探針還能促進YAP蛋白的表達量。

 

9  circYAPeIF4GPABP相互作用區段分析 ([1]

 

進一步,基于分子模擬比對(docking)分析,作者進一步分析了circYAPYAP mRNA,eIF4GPABP相互作用的堿基位點,然后構建了這些位點的突變體(Mut-1,2),其中Mut-1circYAPYAP mRNA相互作用位點的突變體,Mut-2circYAPeIF4GPABP相互作用的位點的突變體,Mut-3為不相關位點的突變對照。結果顯示,過表達Mut-1Mut-2顯著增加YAP蛋白的表達水平,但Mut-3和野生型circYAP則抑制YAP蛋白的表達量。RNA pull-down實驗也表明Mut-1Mut-2不能有效捕獲YAP mRNAeIF4GPABP蛋白。

 

10 circYAPYAPmRNAeIF4GPABP相互作用位點分析 ([1]

 

circYAP與腫瘤遷移侵襲有關

功能實驗表明circYAP抑制克隆形成,抑制增殖,上述的兩個封閉探針能抑制circYAP的這些功能。

 

11 circYAP功能實驗 ([1]

 

circYAP抑制腫瘤遷移,侵襲,封閉探針可抑制circYAP在這方面的功能。

 

12 circYAP功能實驗 ([1]

 

本文從分析circYAP與母基因蛋白表達狀態的相關性分析入手,發現了全新的調控母基因蛋白翻譯起始的新機制模型,為circRNA功能研究提供了全新的思路和參考。

 

參考文獻

1. Nan Wu, Z.Y., Kevin Y. Du, Ling Fang, Juanjuan Lyu, Chao Zhang, Alina He, Esra Eshaghi, Kaixuan Zeng, Jian Ma, William W. Du, Burton B. Yang, Translation of yes-associated protein (YAP) was antagonized by its circular RNA via suppressing the assembly of the translation initiation machinery. Cell Death & Differentiation, 2019.